Пероксидазы

Приготовление конъюгатов антител с пероксидазой хрена

Пероксидазы

Пероксидаза хрена или HRP (Horseradish peroxidase) выделяется из корневищ хрена Armoracia rusticana и является гликопротеином с молекулярной массой около 40 кДа. Содержит в качестве кофакторов гем и два иона кальция. Фермент пероксидаза катализирует реакцию, протекающую по схеме:

субстрат + H2O2 = окисленный субстрат + 2 H2O

Метод конъюгирования основан на использовании полисахаридных цепей фермента для конъюгирования с антителами.

Мягкое окисление остатков сахаров периодатом натрия создает активные альдегидные группы, способные взаимодействовать с аминогруппами иммуноглобулинов с образованием онований Шиффа.

Восстановление полученных оснований Шиффа приводит к формированию стабильных высокомолекулярных конъюгатов (см. схему ниже).

Схема реакции конъюгирования антител с пероксидазой хрена.

Конъюгаты антител с пероксидазой стабильны и могут храниться при +4oС.

Обязательным условием при этом является наличие в растворе бактериостатических компонентов, препятствующих развитию микроорганизмов и протеолитической деградации белкового конъюгата.

Для длительного хранения конъюгатов при температуре −20oС в качестве криопротектора может использоваться глицерин (содержание в растворе — 50%).

Наиболее широко используемый в биохимии бактериостатик азид натрия является ингибитором пероксидазы и не может быть использован при хранении растворов этого белка. В случае, если планируется хранить растворы конъюгата при +4 oС долгое время, используют 0,05% раствор органического бактериостатика ProСlin 300 (Sigma-Aldrich).

Применение: Фермент используется для конъюгирования (соединения с другими веществами) в целях усиления слабого сигнала нужных белков и молекул и их более точной идентификации. Готовые конъюгаты применяются в анализах различного типа: вестерн-блоттинге, иммуноферментных, иммуногистохимических, к примеру, для иммуноферментного определения антител к тиреоидной пероксидазе.

I. Подготовка антител

Для успешной конъюгации пероксидазы с антителами, последние необходимо перевести в 0,1 М Na-карбонатный буфер, рН 9,5. Для этой цели можно использовать колонки на основе Сефадекса-25 для смены буфера фирмы GE Healthcare (NAP-5, NAP-10, PD-10) или диализ.

II. Активация пероксидазы.

1. Навеску 2 мг пероксидазы растворить в 0,4 мл бидистиллированной воды. 2. Приготовить раствор 0,1 М периодата натрия в бидистиллированной воде и сразу же добавить 0,1 мл этого раствора к раствору пероксидазы.

Быстро перемешать, обернуть пробирку с реакционной смесью фольгой (реакция должна проводиться в темноте) и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании.

Признаком образования активной формы пероксидазы служит изменение окраски раствора фермента с желто-коричневой на зеленоватую. При длительном хранении на свету активированная форма быстро переходит в неактивную, при этом зеленая окраска снова переходит в коричневую.

Поэтому все последующие стадии должны осуществляться по возможности быстро.

3. Активированную пероксидазу перевести в буфер пришивки (1 мМ ацетат натрия рН 4,4 на колонке), используя колонку для смены буфера.

III. Конъюгирование антител с пероксидазой

Оптимальное массовое соотношение количества антител к количеству пероксидазы 2:1, т.е. на 2 мг активированной пероксидазы необходимо взять 1 мг антител. Раствор антител к пероксидазе (активированной) добавляется в 0,1 М Na-карбонатном буфере, рН 9,5. Инкубацию реакционной смеси проводить при перемешивании на шейкере в течение 40 минут при +37oС в пробирке, обернутой фольгой.

IV. Восстановление не прореагировавших альдегидных групп пероксидазы боргидридом натрия

Приготовить свежий раствор борогидрида натрия, растворив 2 мг в 0,5 мл бидистиллированной воды. Добавить 0,1 мл полученного раствора к реакционной смеси и инкубировать 20 мин при +37oС.

V. Перевод конъюгата в буфер хранения

Конъюгат антител с пероксидазой перевести в буфер хранения (PBS) на соответствующей колонке для смены буфера или методом диализа, добавить ProClean до конечной концентрации 0,05% и тщательно перемешать. Конъюгат хранить при +4oС. Обратите внимание: возможно хранение конъюгатов при −20°С в присутствии 50% глицерина.

VI. Тестирование полученного конъюгата

Тестирование проводится с использованием метода прямого иммуноферментного анализа путем раститровки полученного конъюгата по антигену.

Также отметим, что в ассортименте продукции Биалекса есть моноклональные АТ к пероксидазе хрена, с помощью которых можно детектировать сам фермент HRP при иммуногистохимических и иммуноферментных анализах.

Источник: http://www.bialexa.ru/technical-support/methods/hrp-conjugate/

АТ-ТПО (антитела к тиреоидной пероксидазе, микросомальные антитела, антитела к микросомальному антигену)

Пероксидазы

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Напоминаем вам, что самостоятельная интерпретация результатов недопустима, приведенная ниже информация носит исключительно справочный характер. АТ-ТПО: показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Показания для назначения исследования

АТ-ТПО – специфические иммуноглобулины, направленные против фермента, содержащегося в клетках щитовидной железы и отвечающего за образование активной формы йода для синтеза тиреоидных гормонов.

Тест назначают для установления или исключения аутоиммунной природы того или иного заболевания щитовидной железы (например, гипер- или гипотиреоза).

АТ-ТПО при беременности способны проникать через плацентарный барьер из крови матери в организм плода, негативно влияя на его развитие.

Подготовка к процедуре

Анализ на определение АТ-ТПО в сыворотке крови лучше сдавать в утреннее время с соблюдением следующих правил:

  • натощак, после 8-14 часов ночного периода голодания (воду пить можно);
  • допустимо днем через 4 часа после легкого приема пищи;
  • рекомендуется исключить физическое и эмоциональное перенапряжение за 24 часа до исследования;
  • желательно прекратить прием стероидных и тиреоидных гормонов за 48 часов до исследования (по согласованию с врачом);
  • не курить в течение 3 часов до исследования.

При необходимости контроля динамики показателя рекомендуется сдавать кровь на исследование в одно и то же время суток.

Антитела к тиреоидной пероксидазе (АТ-ТПО, микросомальные антитела, anti-thyroid)

Синонимы: Антитела к тиреоидной пероксидазе, микросомальные антитела, антитела к микросомальному антигену, АТПО.  Anti-thyroid Peroxidase Autoantibodies, Antimicrosomal Antibodies, Antithyroid Microsomal Antibodies, Thyroid Peroxidase Autoantibodies, TPO Antibodies, Thyroid Peroxidase Test, Thy…

680 руб

1 рабочий день.

  • Гемолиз при неосторожном обращении с пробой крови.
  • Большое количество жиров в сыворотке крови.
  • Недавние воздействия на щитовидную железу, включая:
    • оперативное вмешательство; 
    • радиотерапию; 
    • лекарственную терапию (в том числе, прием тиреоидных гормонов, йодсодержащих препаратов, интерферона, амиодарона, препаратов лития, эстроген-прогестероновых препаратов или препаратов, влияющих на характер иммунного ответа).

Кровь берется в лаборатории из вены. Интерпретация результатов исследования содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.
Референсные границы в значительной степени зависят от применяемого метода исследования. Низкие уровни АТ-ТПО иногда обнаруживаются у практически здоровых людей. Остается неясным, может ли это отражать физиологическую норму, является ли предвестником аутоиммунного тиреоидита или проблемой специфичности метода. В целом выявление АТ-ТПО в сыворотке крови свидетельствует об аутоиммунной агрессии в отношении щитовидной железы, и чем больше результаты анализа отклоняются от нормы, тем выше вероятность наличия патологического процесса. Пределы определения: 3 Ед/мл-1000,0 Ед/мл. Единицы измерения в Независимой лаборатории ИНВИТРО: Ед/мл. Референсные значения: < 5,6 Ед/мл.

  1. хронический тиреоидит (болезнь Хашимото);
  2. болезнь Грейвса (диффузный токсический зоб);
  3. узловой токсический зоб;
  4. подострый тиреоидит (тиреоидит де Кервена);
  5. послеродовая дисфункция щитовидной железы;
  6. аутоиммунный тиреоидит;
  7. идиопатический (с неустановленной причиной возникновения) гипотиреоз;
  8. умеренно повышенные уровни АТ-ТПО могут быть обнаружены у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, не относящимися к щитовидной железе, включая ревматоидный артрит, системную красную волчанку, инсулинзависимый сахарный диабет, аутоиммунную недостаточность надпочечников и пернициозную анемию (дефицит витамина В12);
  9. у 7-10% здоровых людей.

Уменьшение концентрации АТ-ТПО до низких или тем более неопределяемых значений свидетельствует о том, что проводимое лечение успешно.

Источники:

  1. Трошина Е.А., Платонова Н.М., Панфилова Е.А., Панфилов К.О. Аналитический обзор результатов мониторинга основных эпидемиологических характеристик йододефицитных заболеваний у населения Российской Федерации за период 2009—2015 гг. Проблемы эндокринологии, 2018. 64(1): p. 21-37. doi: 10.14341/probl9308 
  2. Бельцевич Д.Г., Ванушко В.Э., Мельниченко Г.А., Румянцев П.О., Фадеев В.В. Клинические рекомендации Российской Ассоциации Эндокринологов по диагностике и лечению (много)узлового зоба у взрослых (2015 год)//Эндокринная хирургия, 2016. 1: p. 5-13. 
  3. Мельниченко Г.А., Фадеев В.В., Дедов И.И. Заболевания щитовидной железы во время беременности (диагностика, лечение, профилактика). Пособие для врачей. М.: 2003.

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Источник: https://www.invitro.ru/library/labdiagnostika/24308/

Пероксидаза, каталаза, анаэробные дегидрогеназы – Страница 6

Пероксидазы

Эти ферменты широко распространены в растительном и животном мире. Пероксидаза (Н2O2-оксидоредуктаза ЕС 1.11.1.

7) катализирует в присутствии перекиси водорода окисление различных органических соединений, фенолов, аминов, а также аскорбиновой и диоксифумаровой кислот. Особенно активная пероксидаза содержится в корнях хрена, откуда и была выделена в кристаллическом виде.

Активность пероксидазы была изучена основоположником эн- зимологии в нашей стране А. Н. Бахом, который впервые разработал и применил метод определения активности пероксидазы.

Этот метод основан на окислении пирогаллола и последующем количественном определении образующегося пурпурогаллина. Источником активного кислорода служит перекись водорода и органические перекиси. Разложение перекиси водорода осуществляется пероксидазой по схеме:

Выделяющийся при этой реакции активный кислород способен окислять ряд органических и неорганических веществ. Пероксидаза с перекисью водорода образует комплексное соединение, в результате чего перекись активируется. В винограде и в процессе его переработки активность пероксидазы проявляется в присутствии перекиси водорода, которая образуется в результате действия флавопротеиновых ферментов. В процессе ферментации сусла вначале действуют о-дифенолоксидаза, аскорбатоксидаза, а затем флавопротеиновые ферменты — гликолатоксидаза, а также оксидаза аминокислот. Два последних фермента способны образовывать перекись водорода и подготавливать среду для действия пероксидазы. Каталаза (ЕС 1.11.1.7) обладает как каталазной, так и пероксидазной активностью. Раньше полагали, что функция каталазы ограничивается только разложением перекиси водорода до O2 и Н2O. В настоящее время установлена и другая важная функция каталазы, заключающаяся в катализе окисления донаторов водорода перекисью водорода [72]. Так, например, каталаза окисляет метанол, этанол и другие спирты, а также альдегиды перекисью водорода. Каталаза действует пероксидативно при низкой концентрации перекиси водорода [72] и при непрерывном поступлении донаторов водорода. Согласно данным Η. М. Сисакяна и его сотрудников (1948), в винограде содержится активная пероксидаза. Ее активность в период формирования листьев до цветения лозы увеличивается, в начале созревания винограда уменьшается, а в период физиологической зрелости вновь возрастает.

Наши исследования показали, что активность пероксидазы и каталазы в процессе брожения уменьшается. Оба фермента в вине полностью инактивируются.

Анаэробные дегидрогеназы

К этой группе относятся ферменты, которые не способны непосредственно передавать водород кислороду, а отдают водород какому-нибудь промежуточному переносчику, как, например, НАД, НАДФ или другим. Анаэробные дегидрогеназы являются двухкомпонентными ферментами и легко диссоциируют при диализе, распадаясь на более активные коферменты.

Коферментами являются никотинамидаде- ниндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ). Эти коферменты очень реакционноспособны в окислительно-восстановительных системах. Они играют важную роль в процессе алкогольного брожения.

В процессе последнего этапа алкогольного брожения в результате декарбоксилирования пировиноградной кислоты и образования уксусного альдегида под действием алкогольдегидрогеназы в уксусный альдегид передается водород от НАДН и образуется этиловый спирт.

Пиридиновые дегидрогеназы, содержащие в качестве коферментов НАД и НАДФ, дегидрируют яблочную, молочную, изолимонную кислоты, глюкозу, различные спирты и другие соединения. А. К. Родопуло [76] показал, что в ягодах винограда содержатся активные дегидрогеназы яблочной, янтарной, лимонной и винной кислот.

В винограде действуют две ферментативные системы, которые приводят к синтезу и превращению яблочной кислоты. В зеленых ягодах винограда содержится более активный маликоэнзим (ЕС 1.1.1.40), синтезирующий яблочную кислоту из пировиноградной и углекислоты. В более зрелых ягодах превалирует дегидрогеназа яблонной кислоты, которая дегидрирует эту кислоту в щавелевоуксусную.

В ягодах винограда также содержатся декарбоксилаза пировиноградной и щавелевоуксусной кислот [76]. Еще в 1962 г. мы показали, что в процессе созревания винограда яблочная кислота дегидрируется в щавелевоуксусную в присутствии дегидрогеназы яблочной кислоты. Затем щавелевоуксусная кислота декарбоксилируется в пировиноградную. Последняя в виде фосфорных соединений превращается в углеводы [76].

Источник: https://vinograd.info/knigi/osnovy-biohimii-vinodeliya/fermenty-6.html

Пероксидаза: фермент в молоке

Пероксидазы

Издавна молоко считается очень полезным продуктом. То, что оно насыщено витаминами и другими важными веществами, знают даже дети. Большим количеством фосфора и кальция в нем уже никого не удивишь, но то, что пероксидаза – это фермент, который также входит в состав молока, знает далеко не каждый.

Что из себя представляет пероксидаза

Сам термин «ферменты» произошел от латинского слова «fermentum», что переводится как «закваска». В природе они выступают как катализаторы – вещества, которые ускоряют протекание реакций в организмах. Эти молекулярные соединения своим действием способны расщеплять основные крупные составляющие клеток: белки, жиры и углеводы.

Продукты распада от таких реакций окисляются, тем самым выбрасывают содержащуюся в них энергию. Также некоторые из них выполняют функции регулирования молочного сахара и общего метаболизма (лактаза), участвуют в образовании крови и костей (фосфатаза), контролируют распад жиров (липаза).

Науке известно около 20 ферментов, которые присутствуют в молоке. Один из них – пероксидаза. Данный катализатор состоит из двух компонентов: белка и активной группы метиленов. Вес молекулы составляет 82 000 Да. Почти половина ее белковой части имеет спиралевидное строение.

Если соединить исследуемый фермент с перекисью водорода, то последняя войдет в состояние активации и выступит в качестве акцептора водорода. Для ускорения реакций понадобится совсем небольшое количество катализатора, начиная с раствора 1 : 5 000 000.

Интересно

Класс, к которому относится пероксидаза – это оксидоредуктазы. Их отличительная черта – наличие железа в составе. Также они обладают свойством ускорения окисления некоторых соединений, в которых присутствует перекись водорода.

Функция данной группы веществ – создание антимикробной среды. Главное значение пероксидазы в том, что она является катализатором процессов окисления и восстановления ароматических аминов и полифенолов. Происходит это благодаря переносу электронов с молекулы восстановителя на окислитель.

С целью продления длительности хранения молока данный компонент следует убрать из состава.

Задача осложняется тем, что для достижения положительного результата необходимо применить высокие температуры, иначе вещество не удалится благодаря своей термоустойчивости.

Инактивирование фермента пероксидазы начинается после нагревания молока хотя бы на 80°С. Для полного удаления нужно достичь температуры до 85°С.

Источники получения

В молоке есть такие компоненты, которые образуются уже после удоя, так как микроорганизмы ведут активную деятельность в свежем продукте. Пероксидаза не относится к этой группе, а попадает в жидкость непосредственно в организме. Происходит это с помощью лейкоцитов, которые переносят избирательно высосанный из крови фермент.

Также в этом процессе участвуют альвеолярные клетки вымени, выполняющие функцию секреции. Повлиять на увеличения количества вещества может качество корма, который съела корова.

Показатель качества пастеризации

Чтобы очистить молоко от патогенных микроорганизмов, удалить ферменты, которые сокращают срок хранения и снижают его качество, проводят пастеризацию. В производстве кисломолочных продуктов выделяют два способа обработки:

  1. Нагревают с помощью стенок аппарата для стерилизации.
  2. Термическая обработка продукта при помощи пара. Этот вид еще называют уперизацией. На вкус сырье остается таким же, а потери полезных веществ, несмотря на температуру обработки от 140°С до 145°С, минимальны.

Чтобы проверить уровень качества пастеризации, используют различные пробы, одна из которых пероксидазная. Суть этого действия состоит в том, что ферменты, как и патогенные микробы, удаляются из молока при высоких температурах, соответственно, наличие или отсутствие первых напрямую указывает на количество вторых.

Существует общепринятый ход действий для проведения данной процедуры.

Понадобится: 5 мл молока, 5 капель йодо-калиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ной перекиси водорода.

Последовательность действий:

  • жидкости поместите в пробирку;
  • добавьте крахмал и йод;
  • перемешайте все в пробирке;
  • определите цвет содержимого.

Если оттенок стал светло-синим или голубым, то пероксидаза в молоке присутствует. Окраска изменилась вследствие того, что она вступила в реакцию с перекисью и крахмалом, качественные характеристики соединения поменялись, йод освободился и изменил цвет жидкости.

Следовательно, пастеризация была при низкой температуре или не проводилась вовсе. Еще возможен такой вариант, что пастеризованное молоко смешалось с обычным.

Если цвет сохранился – это значит, что не было реакции, то есть стерилизация была проведена качественно. Если окраска изменилась позже, чем через две минуты после смешивания компонентов, эксперимент следует провести повторно. Для этого молоко необходимо предварительно прокипятить и охладить.

Особенности лактопероксидазы

Лактопероксидаза – это фермент, который выделятся из различных желез организма, среди которых молочные и слюнные. Впервые это вещество было обнаружено в молоке в конце XIX века.

Отделить пероксидазу как отдельное вещество удалось лишь через 50 лет, в 1932 году. Изначально ученые считали, что все ферменты группы идентичны, но в 1943 году было установлено, что лактопероксидаза имеет отличительные черты.

Одной из них было антибактериальное свойство, которое вырабатывалось благодаря соединению с перекисью водорода.

В 60-ые года XX века было обнаружено, что его высокая концентрация находится в молозиве, которое предшествует грудному молоку. Отсюда было сделано интересное открытие: защиту от бактерий грудной ребенок приобретает вначале от матери в течение первых дней жизни, а потом уже из собственной слюны на 5-7 день после рождения.

Строение лактопероксидазы такое: основная часть — это альфа-спирали, также присутствуют две бета-нити. Молекулы катализатора могут быть соединены со стенками клеток или же независимо распространятся по цитоплазме. В животном организме они выполняют важную роль – способствуют энергетическому обмену и ускоряют расщепление чужеродных веществ.

Фермент может вступать в соединения с цианидом, фторидом, монооксидом углерода и еще с некоторыми веществами, включая перекись водорода. Последняя попадает в организм вследствие окисления глюкозы. Она не повреждает системы организма, так как быстро вступает в реакции с другими веществами.

Ученые применяют лактопероксидазу не только для контроля пастеризации молока, но и во многих областях:

  1. Сфера красоты. Фермент добавляют в кремы по уходу за кожей. В соединении с глюкозой и ее образующих получается эффективное вещество для добавления в уходовые средства для лица и тела из натуральных компонентов.
  2. Медицина. Конъюгаты антител могут уничтожать клетки опухолей, а макрофаги активируются под воздействием лактопероксидазы и направляются подавлять раковые клетки. Также доказана полезность вещества для лечения ВИЧ и герпеса.
  3. Уход за ротовой полостью. Активно идет изучение способностей ферментной системы для поддержания здоровья полости рта. Лактопероксидаза, попадая в качестве зубной пасты в рот человека, может образовывать невидимую пленку, которая выполняет защитную функцию. Также возможен вариант предупреждения раннего развития кариеса, пародонтоза и гингивита. Неприятный зуд во рту может помочь побороть сочетание пероксидазы с лизоцимой, которая разрушает бактерии.

Развитие науки не стоит на месте и стремится к увеличению продолжительности сроков хранения продуктов. Пероксидаза, функции которой обозначены в статье, необходима лишь в свежем молоке для регулирования количества бактерий.

В переработанном сырье ее присутствие уже не нужно, поэтому целесообразно использовать этот компонент, как инструмент для проверки пастеризации продукта, с чем она великолепно справляется. Данный метод на пробу стерилизации утвержден в ГОСТе 3623-73.

Источник: https://moloko-chr.ru/termins/peroksidaza-ferment-v-moloke

Ваш педагог
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: