РЕСТРИКТАЗЫ

Содержание
  1. #57 Рестриктазы New England Biolabs: быстрее, точнее, выгоднее
  2. Ассортимент и качество, которыми можно гордиться
  3. Экономим время с Time-Saver™ рестриктазами
  4. Повышаем точность с High-Fidelity (HF®) рестриктазами
  5. Система NEB-буферов: упрощаем двойную рестрикцию
  6. Ускоряем анализ продуктов рестрикции
  7. Поддержка, которая действительно поддерживает
  8. Функции рестрикционных ферментов, механизм действия, типы и примеры. / биология
  9. функции
  10. Механизм действия
  11. тип
  12. Рестриктазы типа I
  13. Рестриктазы типа II
  14. Подкласс IIA
  15. Подкласс IIB
  16. Подкласс IIC
  17. Подкласс IIE
  18. Рестриктазы типа III
  19. Рестриктазы типа IV
  20. Рестриктазы типа V
  21. примеров
  22. ссылки
  23. Рестриктазы – это что? Определение и классификация рестриктаз
  24. Общая характеристика
  25. Биологическая роль
  26. Особенности действия рестриктаз
  27. Классификация рестриктаз
  28. Номенклатура
  29. Неошизомеры
  30. Изокаудомеры
  31. Применение рестриктаз
  32. Рестрикция ДНК
  33. История изучения
  34. Механизм действия
  35. Необходимость изучения механизмов рестрикции
  36. Практическое применение в медицине и генетике
  37. Перспективы развития
  38. Интересный факт о рестрикции

#57 Рестриктазы New England Biolabs: быстрее, точнее, выгоднее

РЕСТРИКТАЗЫ

20.03.2019

Уже более 7 лет компания SkyGen является официальным дистрибьютором продукции New England Biolabs (NEB). И мы убеждены, что это лучший производитель эндонуклеаз рестрикции на мировом рынке.

В этом обзоре мы рассказали о главных преимуществах и достоинствах рестриктаз NEB, которые выгодно отличают их от продукции других компаний.

Каталог рестриктаз NEB →

Ассортимент и качество, которыми можно гордиться

В настоящее время ни один другой производитель в мире не может похвастаться таким же богатым ассортиментом рестриктаз, как у NEB.

При производстве и очистке свой продукции NEB использует только передовые технологии и подвергает ее самому строгому контролю качества (сертификаты ISO 9001, ISO 13485, ISO 14001).

Экономим время с Time-Saver™ рестриктазами

В отличие от некоторых других производителей компания NEB не стала создавать отдельную дорогостоящую линейку «быстрорежущих» ферментов. Все 35 HF® и 161 стандартная рестриктаза являются таковыми сами по себе.

Time-Saver™ эндонуклеазами рестрикции NEB называются ферменты, которые в количестве 1 мкл (0,5 мкл в случае HF®-рестриктаз) при рекомендованных условиях способны полностью разрезать 1 мкг субстрата ДНК за 15 минут и в то же время не проявляют неспецифической активности при длительной ночной инкубации.

При этом большинство из них справляется со своей работой и за 5 минут!

Все Time-Saver™ рестриктазы в нашем каталоге имеют соответствующую отметку.

Повышаем точность с High-Fidelity (HF®) рестриктазами

Сложные протоколы последовательной модификации ДНК в ходе разных процессов не всегда позволяют выполнять рестрикцию в оптимальных условиях. При этом эндонуклеазы рестрикции могут проявлять неспецифическую активность (называемую также «звездной активностью», от англ. Star Activity), расщепляя ДНК в сайтах, схожих, но не идентичных их сайтам рестрикции.

В случаях, когда такая активность может стать серьезной проблемой и привести к получению нежелательных результатов или их ошибочной интерпретации, мы рекомендуем пользоваться HF® эндонуклеазами рестрикции компании NEB.

HF® рестриктазы – это отдельная линейка аналогов стандартных эндонуклеаз рестрикции NEB, неспецифическая активность которых была существенно подавлена биоинженерными инструментами.

Говоря иными словами, это те же стандартные рестриктазы, но повышенной точности.

HF® ферменты NEB:

EcoRI-HF™ не проявляет неспецифической активности как при 5-минутной (5 мин), так и при длительной (ночь) рестрикции (СЛЕВА), а также при высоких концентрациях фермента (до 10 мкл) (СПРАВА). Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1 мкг ДНК бактериофага λ. Количество фермента, время рестрикции и буфер были выбраны с учетом рекомендаций производителей. Реакционную смесь инкубировали при 37°С. М – маркер длин ДНК 1 т.п.н.

C полным списком HF® рестриктаз NEB можно ознакомиться здесь.

Система NEB-буферов: упрощаем двойную рестрикцию

Рестрицировать ДНК сразу двумя или более ферментами гораздо проще и быстрее, если все они максимально активны в одном и том же буфере.

В настоящее время система основных NEB-буферов включает в себя всего 4 наименования: NEB-буфер 1.1, NEB-буфер 2.1, NEB-буфер 3.1 и NEB-буфер CutSmart®. Все они уже имеют в своем составе БСА и не требуют его добавления.

При этом 215 рестриктаз максимально активны в одном и том же NEB-буфере CutSmart®! Также этот буфер совместим почти с 30 ферментами NEB для модификации ДНК: фосфатазами, полимеразами, нуклеазами, лигазами и др.

Ускоряем анализ продуктов рестрикции

Для ускорения анализа продуктов рестрикции компания NEB вкладывает в упаковку ста самых популярных рестриктаз 6X пурпурный краситель для нанесения на гель.

Этот продукт содержит Ficoll® и SDS, которые делают электрофоретические бэнды более компактными, резкими и яркими. Входящий в состав ЭДТА останавливает происходящие в образце ферментативные реакции. И, наконец, оставшиеся на геле бэнды двух красителей не видны в УФ-свете и не мешают интерпретации результатов.

Поддержка, которая действительно поддерживает

За 45 лет своей деятельности компания NEB накопила богатейший опыт работы с рестриктазами и теперь щедро им делится.

Еще в 1975 году NEB начала ведение базы ферментов рестрикции  REBASE, и сегодня это самый полный и популярный ресурс подобного типа. В REBASE вы можете найти исчерпывающую информацию обо всех когда-либо и кем-либо открытых рестриктазах.
Поисковик  Enzyme Finder позволяет подобрать рестриктазу по нужному сайту рестрикции или образующимся в результате нее концам ДНК.
С помощью инструмента  NEBcutter V2.0 вы сможете не только построить модель расщепления заданной последовательности ДНК конкретными результатами, но и сгенерировать виртуальную электрофореграмму.
Функционал инструмента  NEBcloner® или мобильного приложения NEBtools ( iOS,  Android) значительно облегчает задачу подбора оптимальных условий реакции двойной рестрикции.

Наконец, ни на одном веб-ресурсе вы не найдете столько полезных материалов об эндонуклеазах рестрикции, как на сайте  New England Biolabs:

Каталог рестриктаз NEB →

Чтобы сделать заказ или узнать дополнительную информацию, позвоните по телефону 8 (495) 215-02-22 или 8 (800) 333‑22‑26, напишите по электронной почте info@skygen.сom или свяжитесь с менеджером по вашему региону.

Источник: https://www.skygen.com/podderzhka/obzory/57-restriktazy-new-england-biolabs-bystree-tochnee-vygodnee/

Функции рестрикционных ферментов, механизм действия, типы и примеры. / биология

РЕСТРИКТАЗЫ

ферменты рестрикции они являются эндонуклеазами, используемыми некоторыми археями и бактериями для подавления или «ограничения» распространения вирусов внутри них. Они особенно распространены у бактерий и являются частью их системы защиты от чужеродной ДНК, известной как система ограничения / модификации..

Эти ферменты катализируют разрезание двухцепочечной ДНК в определенных местах, воспроизводимо и без использования дополнительной энергии. Большинство требуют присутствия кофакторов, таких как магний или другие двухвалентные катионы, хотя некоторые также требуют АТФ или S-аденозилметионина.

Эндонуклеазы рестрикции были открыты в 1978 году Дэниелом Натансом, Арбером Вернером и Гамильтоном Смитом, которые получили Нобелевскую премию по медицине за их открытие. Его название обычно происходит от организма, где они наблюдаются впервые.

Такие ферменты широко используются при разработке методов клонирования ДНК и других стратегий молекулярной биологии и генной инженерии. Его характеристики распознавания специфических последовательностей и способность разрезать последовательности рядом с сайтами распознавания делают их мощными инструментами в генетических экспериментах..

Фрагменты, сгенерированные рестрикционными ферментами, которые воздействовали на определенную молекулу ДНК, можно использовать для воссоздания «карты» исходной молекулы, используя информацию о местах, где фермент режет ДНК..

Некоторые рестриктазы могут иметь один и тот же сайт узнавания в ДНК, но они не обязательно обрезают его одинаковым образом. Таким образом, существуют ферменты, которые делают разрезы, оставляя тупые концы, и ферменты, которые делают разрезы, оставляя когезивные концы, которые имеют различные применения в молекулярной биологии..

В настоящее время существуют сотни различных коммерчески доступных ферментов рестрикции, предлагаемых различными коммерческими фирмами; эти ферменты работают как «обычные» молекулярные ножницы для разных целей.

индекс

  • 1 Функции
  • 2 Механизм действия
  • 3 типа
    • 3.1 Тип I рестриктазы
    • 3.2 Тип II рестриктазы
    • 3.3 Тип III рестриктазы
    • 3.4 Рестрикционные ферменты типа IV
    • 3.5 Рестрикционные ферменты типа V
  • 4 примера
  • 5 ссылок

функции

Ферменты рестрикции выполняют противоположную функцию полимераз, поскольку они гидролизуют или разрушают сложноэфирную связь внутри фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами в нуклеотидной цепи..

В молекулярной биологии и генной инженерии они широко используют инструменты для конструирования векторов экспрессии и клонирования, а также для идентификации конкретных последовательностей. Они также полезны для конструирования рекомбинантных геномов и имеют большой биотехнологический потенциал..

Последние достижения в генной терапии позволяют в настоящее время использовать ферменты рестрикции для введения определенных генов в векторы, которые являются носителями для транспорта таких генов в живые клетки и которые, вероятно, способны вставляться в геном клетки для осуществления постоянные изменения.

Механизм действия

Рестрикционные ферменты могут катализировать разрезание двухцепочечной ДНК, хотя некоторые способны распознавать одноцепочечные последовательности ДНК и даже РНК. Разрез происходит после распознавания последовательностей.

Механизм действия заключается в гидролизе фосфодиэфирной связи между фосфатной группой и дезоксирибозой в основной цепи каждой цепи ДНК. Многие из ферментов могут разрезать в том же месте, которое они распознают, в то время как другие перерезают от 5 до 9 пар оснований до или после него..

Обычно эти ферменты резают на 5'-конце фосфатной группы, образуя фрагменты ДНК с 5'-фосфорильным концом и концевым 3'-гидроксильным концом.

Поскольку белки не вступают в прямой контакт с сайтом узнавания в ДНК, они должны быть последовательно перемещены до тех пор, пока не достигнут конкретного сайта, возможно, посредством «скользящих» механизмов на цепи ДНК..

Во время ферментативного разрезания фосфодиэфирная связь каждой из цепей ДНК расположена в одном из активных сайтов рестрикционных ферментов. Когда фермент покидает сайт распознавания и разрезания, он делает это через неспецифические переходные ассоциации.

тип

В настоящее время известно пять типов ферментов рестрикции. Ниже краткое описание каждого:

Рестриктазы типа I

Эти ферменты представляют собой большие пентамерные белки с тремя субъединицами, ограничением, метилированием и другим для распознавания последовательностей в ДНК. Эти эндонуклеазы представляют собой многофункциональные белки, способные катализировать реакции рестрикции и модификации, они обладают АТФазной активностью, а также ДНК-топоизомеразой..

Ферменты этого типа были первыми эндонуклеазами, которые были открыты, они были впервые очищены в 1960-х годах, и с тех пор их изучали с большой глубиной..

Ферменты типа I не используются широко в качестве биотехнологического инструмента, поскольку участок резки может находиться на переменном расстоянии до 1000 пар оснований от сайта распознавания, что делает их ненадежными с точки зрения воспроизводимости эксперимента..

Рестриктазы типа II

Они представляют собой ферменты, состоящие из гомодимеров или тетрамеров, которые разрезают ДНК в определенных сайтах длиной от 4 до 8 п.н. Эти места резания обычно являются палиндромными, то есть они распознают последовательности, которые считываются одинаково в обоих направлениях..

Многие из ферментов рестрикции типа II в бактериях разрезают ДНК, когда они распознают свой чужеродный характер, поскольку они не обладают типичными модификациями, которые должна иметь собственная ДНК..

Это простейшие рестрикционные ферменты, так как им не требуется никакого кофактора, кроме магния (Mg +), для распознавания и разрезания последовательностей ДНК..

Точность ферментов рестрикции типа II в распознавании и разрезании простых последовательностей в ДНК в точных положениях делает их одними из наиболее используемых и незаменимых в большинстве отраслей молекулярной биологии..

Внутри группы ферментов рестрикции типа II имеется несколько подклассов, классифицированных в соответствии с определенными свойствами, которые являются уникальными для каждого из них. Классификация этих ферментов осуществляется путем добавления букв алфавита от А до Z, следующих за названием фермента..

Некоторые из подклассов, наиболее известных своей полезностью:

Подкласс IIA

Это димеры разных субъединиц. Они распознают асимметричные последовательности и используются в качестве идеальных предшественников для генерации режущих ферментов..

Подкласс IIB

Они состоят из еще одного димера и разрезают ДНК с обеих сторон последовательности распознавания. Они разрезали обе цепи ДНК в диапазоне пар оснований за пределами сайта узнавания.

Подкласс IIC

Ферменты этого типа представляют собой полипептиды с функциями деления и модификации цепей ДНК. Эти ферменты асимметрично разрезали обе цепи.

Подкласс IIE

Ферменты этого подкласса наиболее широко используются в генной инженерии. Они имеют каталитический сайт и обычно требуют аллостерического эффектора. Эти ферменты должны взаимодействовать с двумя копиями их последовательности распознавания, чтобы сделать эффективный разрез. Внутри этого подкласса находятся ферменты EcoRII и EcoRI.

Рестриктазы типа III

Эндонуклеазы рестрикции типа III состоят только из двух субъединиц, одна отвечает за распознавание и модификацию ДНК, а другая отвечает за разрезание последовательности.

Эти ферменты требуют два кофактора для их функционирования: АТФ и магния. Рестрикционные ферменты этого типа обладают двумя асимметричными сайтами распознавания, транслоцируют ДНК АТФ-зависимым образом и обрезают ее между 20 и 30 п.н. рядом с сайтом распознавания..

Рестриктазы типа IV

Ферменты типа IV легко идентифицировать, поскольку они разрезают ДНК метилирующими метками, они состоят из нескольких различных субъединиц, которые отвечают за распознавание и разрезание последовательности ДНК. Эти ферменты используют в качестве кофакторов ГТФ и двухвалентного магния.

Конкретные сайты для разрезания включают нуклеотидные цепи с остатками метилированного или гидроксиметилированного цитозина в одной или обеих цепях нуклеиновых кислот.

Рестриктазы типа V

Эта классификация группирует ферменты типа CRISPER-Cas, которые идентифицируют и отрезают определенные последовательности ДНК от инвазивных организмов. В ферментах Cas используется цепь синтезированной направляющей РНК CRISPER для распознавания и нападения на вторгающиеся организмы..

Ферменты, классифицируемые как тип V, представляют собой полипептиды, структурированные ферментами типа I, II и II. Они могут разрезать участки ДНК практически любого организма и с большим диапазоном длины. Их гибкость и простота использования делают эти ферменты одним из наиболее часто используемых инструментов в генной инженерии сегодня наряду с ферментами II типа..

примеров

Рестрикционные ферменты использовались для обнаружения полиморфизмов ДНК, особенно в исследованиях популяционной генетики и эволюционных исследованиях с использованием митохондриальной ДНК, чтобы получить информацию о скоростях нуклеотидных замен..

В настоящее время векторы, используемые для трансформации бактерий различного назначения, имеют сайты с множественной болью, в которых обнаруживаются сайты узнавания для множества рестрикционных ферментов..

Среди этих ферментов наиболее популярными являются EcoRI, II, III, IV и V, полученные и описанные впервые Кишечная палочка; HindIII, из H. influenzae и BamHI's B. amyloliquefaciens.

ссылки

  1. Bickle, T.A., & Kruger, D.H. (1993). Биология рестрикции ДНК. Микробиологические обзоры, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A. & Horvath, P. (2007). CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот. наука, 315(Март) 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Молекулярная перспектива: эндонуклеазы рестрикции. Основы стволовых клеток раковой медицины, 20, 190-191.
  4. Halford, S.E. (2001). Прыжки, прыжки и петли с помощью ферментов рестрикции. Биохимическое общество Сделки, 29, 363-373.
  5. Ельч А. (2003). Поддержание видовой идентичности и контроль видообразования бактерий: новая функция для систем ограничения / модификации? ген, 317, 13-16.
  6. Кребс Дж., Гольдштейн Э. и Килпатрик С. (2018). Гены Левина XII (12 изд.). Берлингтон, Массачусетс: Джонс и Бартлетт Лирнинг.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., … She, Q. (2015). Использование систем CRISPR-Cas типа I и типа III для редактирования генома. Исследование нуклеиновых кислот, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T.F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Ферменты рестрикции типа I и их родственники. Исследование нуклеиновых кислот, 1-25.
  9.  Натанс Д. и Смит Х. О. (1975). Эндонуклеазы рестрикции в анализе и перестройке молекул ДНК. Annu. Преподобный Биохим., 273-293.
  10.  Nei, M. & Tajima, F. (1981). ДНК-полиморфизм, определяемый рестрикционными эндонуклеазами. генетика, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. & Wende, W. (2005). Клеточные и молекулярные рестрикционные эндонуклеазы II типа: структура и механизм. CMLS Клеточные и молекулярные науки о жизни, 62, 685-707.
  12.  Робертс Р. (2005). Как ферменты рестрикции стали рабочими лошадками молекулярной биологии. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Робертс Р. Дж. И Мюррей К. (1976). Рестрикционные эндонуклеазы. Критические обзоры в биохимии, (Ноябрь), 123-164.
  14.  Стоддард, Б. Л. (2005). Структура и функция эндонуклеазы Хоминг. Ежеквартальные обзоры биофизики, 1-47.
  15.  Tock, M.R. & Dryden, D.T.F. (2005). Биология ограничения и антирестрикции. Современное мнение в микробиологии, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G.G. & Murray, N.E. (1991). Системы ограничения и модификации. Annu. Преподобный Генет., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z. & Mou, K. (2016). Геномное понимание вирулентности Campylobacter jejuni и популяционной генетики. Infect. Дис. Перев. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Юань Р. (1981). Структура и механизм полифункциональных рестрикционных эндонуклеаз. Annu. Преподобный Биохим., 50, 285-315.

Источник: https://ru.thpanorama.com/articles/biologa/enzimas-de-restriccin-funciones-mecanismo-de-accin-tipos-y-ejemplos.html

Рестриктазы – это что? Определение и классификация рестриктаз

РЕСТРИКТАЗЫ

Рестриктазы — это особые ферменты, способные разрезать цепочки ДНК в строго определенных местах. Именно в специфичности действия заключается главное отличие данной группы белков от других видов эндонуклеаз. Благодаря этому уникальному свойству ферменты рестрикции нашли широкое применение в генной инженерии.

Рестриктазы — это уникальные ферменты бактерий. Впервые эти белки были выделены в 1968 году из штаммов Esherihia colli. Дальнейшие исследования выявили присутствие эндонуклеаз рестрикции в одноклеточной водоросли Chlorella, а также в нескольких культурах дрожжей Sachoromyces и Pichia. В клетках других эукариотов рестриктазы пока не обнаружены.

Общая характеристика

Рестриктазы — ферменты, относящиеся к группе гидролаз, поскольку катализируют гидролиз фосфодиэфирной связи между нуклеотидами в цепочке ДНК. Место, в котором происходит разрезание, называется сайтом рестрикции. Последний может находиться как внутри опознаваемой последовательности, так и на расстоянии от нее.

Специфичный для рестриктазы участок распознавания обычно состоит из 4-8 нуклеотидов. Так как азотистые основания обращены внутрь двойной спирали, фермент находит нужную последовательность за счет взаимодействия с большой бороздкой ДНК.

Каждая рестриктаза имеет свой сайт распознавания и может функционировать только после связывания с ним.

Биологическая роль

Бактерии рестриктазы — это важнейший инструмент защиты клетки от бактериофагов. Основная задача ферментов данной группы состоит в разрезании проникшего в клетку чужеродного генетического материала. Фрагментирование нуклеиновой кислоты препятствует ее репликации, а значит, и размножению вируса.

Последовательности, к которым специфичны рестриктазы, с определенной периодичностью встречаются в геноме самой бактерии и потому подвергаются метилированию, которое не позволяет рестриктазам распознать свои мишени. Этот процесс осуществляется ферментами метилазами.

Механизм, направленный на разрезание чужеродной ДНК и защищающий от нуклеазной активности собственную, называется системой рестрикции-модификации. Некоторые типы рестриктаз способны проявлять как эндонуклеазную, так и метилазную активность.

На настоящий момент известно более 1000 бактериальных рестриктаз. Очень часто они рассматриваются не как отдельные ферменты, а в комплексе систем рестрикции-модификации.

Особенности действия рестриктаз

После связывания с последовательностью распознавания эндонуклеаза рестрикции поочередно расщепляются цепи ДНК. При этом могут образовываться два варианта концов:

  • Липкие — одноцепочечные комплементарные друг другу последовательности, которые легко могут “сшиться” обратно. Формируются при ступенчатой траектории разрезания, когда точки расщепления двух цепей не совпадают;
  • Тупые — одноцепочечные участки в месте разрыва ДНК не образуются, точки разрезания цепей находятся напротив друг друга.

Для осуществления эндонуклеазной активности рестриктазам требуется кофактор в виде Mg2+. Расположившись на месте разрыва этот ион вмешивается в конфигурацию ДНК, что способствует последующему расщеплению.

Классификация рестриктаз

По строению и механизму действия все рестриктазы разделяют на 2 класса. К первому относятся ферменты, обладающие исключительно рестрикционной активностью, а метилирование осуществляется другим белком с аналогичной субстратной специфичностью.

Рестриктазы класса II представляют собой мультиферментные комплексы, способные как разрезать, так и модифицировать ДНК. Эти белки состоят из 3 функциональных субъединиц:

  • сайт-узнающей;
  • метилирующей;
  • рестриктирующей.

Есть и другая разновидность рестриктаз того же класса, для которой характерна структура из двух субъединиц. Такие ферменты называют бифункциональными.

Метилазная и эндонуклеазная активности у разных рестриктаз могут осуществляться одновременно, либо исключать друг друга. Эффект действия таких ферментов зависит от условий реакции.

В пределах двух классов выделят три типа рестиктаз (I, II и III), которые различаются по следующим характеристикам:

  • структурная организация;
  • выполняемые функции;
  • особенности субстратной специфичности;
  • потребность в кофакторах;
  • расположение сайта рестрикции относительно участка распознавания;
  • обратимость реакции рестрикционного гидролиза;
  • потребность в энергии АТФ;
  • механизм действия.

Тип II соответствует первому классу эндонуклеаз рестрикции, а первый и третий типы являются разновидностями класса II.

Характеристика эндонуклеаз рестрикции
ТипIIIIII
Структура3 разные субъединицыОдна или несколько идентичных субъединиц2 различные субъединицы
ФункцииРестрикция и метилированиеРестрикцияРестрикция и метилирование
Реакции гидролиза и метилированияВзаимоисключающиеОтдельные реакции (для каждой свой фермент)Возможно одновременное проявление
Расположение сайта разрезанияСлучайное, не менее 1000 пар нуклеотидов от распознаваемой последовательностиВнутри распознаваемой последовательностиНа расстоянии 24-26 нуклеотидных пар от последовательности распознавания
Кофакторы рестрикцииS-анедозил-L-метионин (Адо-мет), Mg2+, АТФMg2+Mg2+, АТФ (необходимы);Адо-мет (необязателен, стимулирует реакцию)
Кофакторы метилированияАдо-мет (необходим);Mg2+ и АТФ (стимулируют реакцию)нет метилированияАдо-мет (необходим);Mg2+ и АТФ (стимулируют реакцию)
Энзиматическая обратимость рестриктазной реакцииЕстьНетНет
Последовательность распознаванияПрерывистая, вращательная симметрия отсутствуетКороткие последовательности, обладающие вращательной симметрией второго порядкаПоследовательность имеет некоторые элементы симметрии либо полностью лишена последней
Транслокация ДНК перед разрезаниемЕстьНетНет

Кроме трех основных разновидностей рестриктаз выделяют еще два типа:

  • IIS — отличается от типа II тем, что система рестрикции-модификации кодируется не двумя, а тремя генами, а сайт разрезания находится вне последовательности распознавания (на фиксированном расстоянии);
  • Mcr/Mrr — содержит несколько разных субъединиц при отсутствии модификационной активности, для работы требуется ГТФ, расщепляет ДНК с метилированными аденином и цитозином.

Рестриктазы первого и третьего типов характеризуются неполным гидролизом цепей ДНК и потому практически не используются в технологиях генной инженерии.

Номенклатура

Обычно в названии рестриктазы содержится информация о том, из какого микроорганизма она была выделена. При этом, информация указывается в следующем порядке:

  • род и вид;
  • штамм;
  • номер фермента (если данный микроорганизм содержит несколько систем рестрикции-модификации).

Иногда в название включают информацию о локализации генов, кодирующих рестриктазу.

Номенклатура для рестрикционных ферментов была разработана Смиттом и Натансом. Она базируется на следующих принципах:

  • Первая латинская буква обозначает род, а две последующие – вид микроорганизма.
  • Далее латинской буковой указывается штамм или внехромосомный элемент, кодирующий рестриктазу.
  • В конце римской цифрой обозначается номер фермента.

Таким образом, вторая по счету рестриктаза, выделенная из штамма d бактерии Haemophilus influenzae будет обозначаться HindII.

Существует еще одна классификация ферментов рестрикции, основывающаяся на их специфичности к субстрату.

Изошизомеры — это рестриктазы с разным происхождением, но одинаковой субстратной специфичностью. Такие рестриктазы могут быть выделены даже из отдаленных таксонов бактерий. Открытие изошизомеров опровергло предположение о строгой таксоноспецифичности рестриктаз, утверждавшее, что участки распознавания для этих ферментов у разных видов микроорганизмов уникальны.

Неошизомеры

Неошизомерами называются рестриктазы, имеющие общий участок распознавания, но разные сайты рестрикции. Например, для ферментов SmaI и XmaI специфична последовательность CCCGGG, но в одном случае разрезание проходит посередине (CCC/GGG), а в другом расщепляется связь между первым и вторым нуклеотидами (C/CCGGG).

Изокаудомеры

К изокаудомерам относят ферменты рестрикции с разной субстратной специфичностью, которые формируют одинаковые концы. Предполагается, что белки данной группы не являются родственными.

Применение рестриктаз

Рестриктазы являются одним из главных молекулярных инструментов, используемых в технологии рекомбинантных ДНК. Благодаря этим ферментам стало возможным вырезать из геномов различных организмов определенные фрагменты или гены, а затем сшивать их с помощью лигаз.

Особенно удобно использование в генной инженерии рестриктаз, образующих одинаковые липкие концы. Такие фрагменты ДНК легко соединяются по принципу комплементарности

Источник: https://FB.ru/article/400296/restriktazyi---eto-chto-opredelenie-i-klassifikatsiya-restriktaz

Рестрикция ДНК

РЕСТРИКТАЗЫ

Рестрикцией ДНК (латинское restrictio – ограничение) называется процесс ферментативного разделения цепочек дезоксирибонуклеиновой кислоты на отдельные фрагменты, представляющие собой последовательность нуклеотидов различного размера.

Этот процесс является частью одного из важнейших внутриклеточных защитных механизмов от проникновения и встраивания в геном чужеродного генетического материала. Он контролируется сложной системой клеточной регуляции. Другой стороной применения этого явления является синтетическая генная инженерия, которую нельзя было бы вообразить без возможности разделять ДНК-материал на фрагменты.

История изучения

Механизмы рестрикции внутри системы защиты клетки неразрывно связаны с механизмом модификации, и начиная с середины 20 века многие учёные задавались целью изучить эти явления. Впервые фермент-рестриктаза, способный неспецифически делить последовательность ДНК, был обнаружен в бактерии E.coli (кишечной палочке) учёными Юанем и Мезельсоном (1968г).

Было выяснено, что бактерии способны легко отличать «чужеродный» генетический материал (независимо от пути его проникновения в клетку) от собственного, в результате чего привнесённая ДНК последовательно расщеплялась на мелкие фрагменты.

Распознавание происходит с помощью специальных «меток» — модифицированных (метилированных) участков собственной ДНК, во «вражеском» же геноме такие участки отсутствуют.

В 1970г. исследователи Смит и Вилькокс выделили из гемофильной палочки первую рестриктазу, которая могла расщепить только специфические последовательности ДНК.

В последующем было открыто более 500 различных рестрикционных эндонуклеаз, которые распознают, прикрепляются, расщепляют разные последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Механизм действия

Специфичность

Все эндогенные рестриктазы высокоспецифичны. Они четко распознают определенную цепочку нуклеотидов, но могут «разрезать» её по-разному. Как правило, узнается короткая последовательность из 4 — 6 оснований.

Особенностью процесса рестрикции-модификации является защита собственной ДНК от сайт-специфичной эндодезоксирибонуклеазы (рестриктазы) с помощью метилирования.

Этот процесс осуществляется ферментами метилазами, также действующими избирательно к азотистым основаниям, расположенным в определенном порядке, и добавляющими к ним метильные группы, делая сайт молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты устойчивым к рестрикции.

Группы рестриктаз

Выделяют три особенных класса рестриктаз. Они отличаются по нескольким признакам: строению, точкам применения.

Рестриктазы первого класса разрезают молекулы генетического материала в произвольных точках, а ферменты второго и третьего классов — в строго определенных. При этом эндорестриктазы второго класса действуют в пределах одного сайта, а третьего — рядом с сайтом узнавания.

Рестриктазы второго класса имеют отдельную двухбелковую структуру, отличаясь от первого и третьего классов со сложным строением и АТФ-зависимостью, что позволяет использовать их для генной инженерии. Фермент второго класса состоит из двух действующих частиц: рестриктирующей эндонуклеазы, модифицирующей метилазы, которые действуют только вместе с ионами магния.

Благодаря достижениям молекулярной биохимии, ученые смогли выделить более пятисот специфичных рестриктаз второго класса.

Но как выяснилось по ходу исследований, некоторые из них действуют на одинаковые последовательности нуклеотидов. Такие ферменты получили название — изошизомеры.

Истинные изошизомеры делят сайт ДНК по одной точке, а гетерошизомеры, выбирая одинаковый сайт, осуществляют рестрикцию в разных его местах.

Как уже было указано, рестриктазы чаще выделяют последовательность из 4 или 6 азотистых оснований, а потому, в зависимости от количества, делятся на мелко- и крупнощемящие.

Механизм действия

Эндогенная рестриктаза распознает определенную последовательность ДНК — сайт узнавания. В большинстве случаев он является палиндромом, то есть порядок расположения нуклеотидов одинаков при чтении справа налево и слева направо. Например, 3′-AGATCT-5′ или 5′-TCTAGA-3′.

Фермент прочно связывается с узнанным рядом азотистых оснований, а затем при движении цепочек молекулы «находит» сайт разрезания.

Рестрикция возможна с образованием тупых (blunt) и липких (sticky) концов. Тупые концы образуются, если рестриктаза делит цепочки ДНК друг напротив друга. А липкие концы характеризуются образованием коротких и длинных хвостов (3′-, 5′-концов) из-за несимметричного разрезания палиндромов. Липкие концы самокомплементарны, то есть способны восстановить структуру при соединении.

Необходимость изучения механизмов рестрикции

Изучение процессов рестрикции существенно упростило исследовательскую деятельность, так как с ее помощью стало возможным разделение единицы генетического материала на небольшие части.
С помощью физических методов (электрофорез с агарозой) фрагменты можно разделить по размеру, а затем изучить каждый в отдельности, построив рестрикционные карты.

Практическое применение в медицине и генетике

Если несколько упростить и схематично отобразить алгоритм действий генной инженерии, то мы получим следующее: сначала необходимо выделить исходную информацию из исследуемого материала, затем разделить её на части, последовательности, потом объединить, синтезировать различные фрагменты воедино для возникновения новой структуры генетической информации, обладающей заданными характеристиками, и в последующем ввести новый материал другому организму.

Расщепление ДНК (рестрикция) является основой генетической инженерии и находит своё применение во множестве ежедневно проводимых исследований.

На основе нуклеотидных последовательностей, полученных при разделении цепочек различных молекул, создаются искусственные рекомбинантные ДНК, которые находят широкое применение во многих отраслях человеческой жизни.

Значительное количество научных работ посвящены исследованию возможности лечения таких непобедимых на сегодня заболеваний как ВИЧ-инфекция, опухоли и пр.

Например, путём присоединения к генам, кодирующим белки-рецепторы заражённых вирусом клеток, другого гена, который способствует синтезу растительного яда, нарушается процесс биосинтеза белка в цитоплазме, что ведет к их гибели. В перспективе могут быть найдены подходы к лечению множества наследственных врожденных и приобретённых заболеваний, причем на самом раннем этапе — на молекулярном, субмолекулярном уровнях.

Известны исследования в области фармацевтики, улучшающие характеристики производимых лекарств и способы их доставки к клеткам, тканям организма.

Сделала крупные шаги вперед трансплантология, позволяя выращивать донорские органы в различных животных или даже просто в пробирках с питательными средами, при этом исключая энзимную несовместимость благодаря генной модификации.

Перспективы развития

Генетическая инженерия предоставляет огромные возможности в вопросах улучшения существующих организмов или создания новых, способных существенно поднять продуктивность биотехнологических процессов, приумножить их хозяйственную ценность для человека.

Генетически модифицированные продукты прочно обосновались в нашей жизни, и, несмотря на некоторые скептические мнения экспертов, большинство учёных склоняется к выводу, что за ГМО стоит будущее в вопросах продуктового обеспечения человечества.

В последующем ученым могут открыться новые горизонты для исследований метаболизма, замедления процессов старения, разработки и использования новейших бионанотехнологий применительно к человеческому организму.

Интересный факт о рестрикции

Ученый Ренди Люис (к слову, большой поклонник Человека-паука) провел рестрикцию генома паука, выделив фрагменты, отвечающие за производство каркасной паутины (самой прочной), а затем встроил их в гены выработки молока у коз. Результатом стало появление козлят, вырабатывающих молоко и паутину.

Источник: https://testdnk.pro/informacia/restrikciya-dnk.html

Ваш педагог
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: