Спектрофотометрия

ОФС.1.2.1.1.0003.15 Спектрофотометрия в УФ и видимой областях

Спектрофотометрия

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Взамен ОФС ГФ X, ОФС ГФ XI, ОФС 42-0042-07 ГФ XII, ч.1

Уменьшение интенсивности монохроматического излучения, проходящего через гомогенную поглощающую среду, количественно описывается законом Бугера-Ламберта-Бера:

log10(1/Т) = А = ε ∙ c ∙ b ,(1)

где:

  • Т – пропускание, отношение интенсивности светового потока, прошедшего через вещество, к интенсивности падающего на вещество светового потока; Т = I/I0;
  • I – интенсивность прошедшего монохроматического излучения;
  • I0 – интенсивность падающего монохроматического излучения;
  • ε – молярный показатель поглощения;
  • с – молярная концентрация вещества в растворе;
  • b – длина оптического пути или толщина слоя, в сантиметрах.

Величина log10(1/Т) носит название оптической плотности, обозначается буквой А и является измеряемой величиной. В отсутствии других физико-химических факторов измеренная оптическая плотность (А) пропорциональна концентрации вещества в растворе (с) и толщине слоя (b).

Величина   представляет собой удельный показатель поглощения, т.е. оптическую плотность раствора вещества с концентрацией 10 г/л (1 г/100 мл) в кювете с толщиной слоя 1 см. Величины  и ε связаны соотношением:

где:

М.м. – молекулярная масса исследуемого вещества.

Измерение оптической плотности

Если нет других указаний в фармакопейной статье, измерение оптической плотности проводят при указанной длине волны с использованием кювет с толщиной слоя 1 см и при температуре (20 ± 1) °С по сравнению с тем же растворителем или той же смесью растворителей, в которой растворено вещество. При измерении оптической плотности раствора при данной длине волны оптическая плотность кюветы с растворителем, измеренная против воздуха при той же длине волны, не должна превышать 0,9 и, желательно, чтобы она была не менее 0,2.

Спектр поглощения представляют таким образом, чтобы оптическая плотность или ее некоторая функция были приведены по оси ординат, а длина волны или некоторая функция длины волны – по оси абсцисс.

Если в фармакопейной статье для максимума поглощения указывается только одна длина волны, то это означает, что полученное значение максимума не должно отличаться от указанного более чем на ± 2 нм.

Приборы

Спектрофотометры, предназначенные для измерений в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, состоят из оптической системы, выделяющей монохроматическое излучение в области от 190 до 800 нм и обеспечивающей его прохождение через образец, и устройства для измерения оптической плотности.

Основными частями этих приборов являются: источник излучения, диспергирующий прибор (призма или решетка), щель для выделения полосы длин волн, кюветы для образцов, детектор излучаемой энергии, встроенные усилители и измерительные приборы.

Проверка шкалы длин волн в ультрафиолетовой и видимой области. Точность калибровки прибора по шкале длин волн в спектральном ряду проверяют по приведенным в табл.

1 спектральным линиям водородной (Hβ) или дейтериевой (Dβ) разрядной лампы, линиям паров ртути (Hg) кварцево-ртутной дуговой лампы, а также по максимумам поглощения раствора гольмия перхлората (Ho) (готовый реактив для калибровки спектрофотометра представляет собой 4 % раствор гольмия оксида в 14,1% растворе хлорной кислоты). Допустимое отклонение составляет ± 1 нм для ультрафиолетовой и ± 3 нм для видимой области.

Таблица 1 – Максимумы поглощения для проверки шкалы длин волн

241,15 нм (Но)404,66 нм (Hg)
253,7 нм (Hg)435,83 нм (Hg)
287,15 нм (Но)486,0 нм (Dβ)
302,25 нм (Hg)486,1 нм (Нβ)
313,16 нм (Hg)536,3 нм (Но)
334,15 нм (Hg)546,07 нм (Hg)
361,5 нм (Но)576,96 нм (Hg)
З65,48 нм (Hg)579,07 нм (Hg)

Шкала длин волн может быть калибрована также при помощи подходящих стеклянных фильтров, которые имеют фиксированные полосы поглощения в видимой и ультрафиолетовой областях, а также стандартных стекол, содержащих дидим (смесь празеодима и неодима), и стекол, содержащих гольмий.

Проверка шкалы оптической плотности. Для проверки шкалы оптической плотности используют стандартные неорганические стеклянные фильтры или раствор калия дихромата при длинах волн, указанных в табл. 2, где для каждой длины волны приведено точное значение удельного показателя поглощения  и допустимые пределы.

Раствор калия дихромата для проверки шкалы оптической плотности при 235, 257, 313 и 350 нм готовят следующим образом: от 57,0 до 63,0 мг (точная навеска) калия дихромата, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 130 °С, растворяют в 0,005 М растворе серной кислоты и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000 мл. Для проверки оптической плотности при 430 нм, растворяют 57,0-63,0 мг (точная навеска) калия дихромата в 0,005 М растворе серной кислоты и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.

Таблица2 ‑ Удельный показатель поглощения стандартов при различных длинах волн

Длина волны, в нанометрахУдельный показатель поглощения Допустимые пределы для 
235124,5От 122,9 до 126,2
257144,5От 142,8 до 146,2
31348,6От 47,0 до 50,3
350107,3От 105,6 до 109,0
43015,9От 15,7 до 16,1

Предельный уровень рассеянного света. Рассеянный свет может быть обнаружен при данной длине волны с использованием соответствующих фильтров или растворов: например, оптическая плотность раствора 12 г/л калия хлорида в кювете с толщиной слоя 1 см резко увеличивается между 220 и 200 нм и должна быть больше 2 при 198 нм при использовании воды в качестве раствора сравнения.

Разрешающая способность (для качественного анализа). Если есть указание в фармакопейной статье, определяют разрешающую способность спектрофотометра следующим образом.

Записывают спектр 0,02 % (об/об) раствора толуола в гексане.

Минимально допустимое значение отношения оптической плотности в максимуме поглощения при 269 нм к оптической плотности в минимуме поглощения при 266 нм указывают в фармакопейной статье.

Ширина спектральной щели (для количественного анализа). В случае использования спектрофотометра с изменяемой шириной спектральной щели при выбранной длине волны возможны погрешности, связанные с шириной этой щели.

Для их исключения ширина щели должна быть малой по сравнению с полушириной полосы поглощения (шириной на половине оптической плотности) и в то же время должна быть максимально велика для получения высокого значения интенсивности падающего монохроматического излучения (I0).

Таким образом, ширина щели должна быть такой, чтобы дальнейшее ее уменьшение не изменяло величину измеряемой оптической плотности.

Кюветы. Допустимые отклонения в толщине слоя используемых кювет должны быть не более ±0,005 см. Кюветы, предназначенные для испытуемого раствора и раствора сравнения, должны иметь одинаковое пропускание (или оптическую плотность) при заполнении одним и тем же растворителем. В противном случае это различие следует учитывать.

Требования к растворителям.

Для определений, производимых в ультрафиолетовой и видимой областях, образец анализируемого вещества растворяют в соответствующем растворителе, который должен быть оптически прозрачным в используемой области длин волн. Для этих областей длин волн пригодны многие растворители, в том числе вода, спирты, хлороформ, низшие углеводороды, эфиры и разбавленные растворы сильных кислот и щелочей.

Идентификация

Абсорбционную спектрофотометрию в ультрафиолетовой и видимой областях спектра применяют для определения подлинности лекарственных средств путем:

— сравнения спектров поглощения испытуемого раствора и раствора стандартного образца; в указанной области спектра должно наблюдаться совпадение положений максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба;

— указания положений максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба спектра поглощения испытуемого раствора; расхождение между наблюдаемыми и указанными длинами волн в максимумах и минимумах поглощения не должно обычно превышать ± 2 нм.

Возможны и другие варианты применения, оговоренные в фармакопейных статьях.

Количественное определение

Определение концентрации веществ спектрофотометрическим методом основано на использовании закона Бугера-Ламберта-Бера:

где:

С – концентрация вещества в г/100 мл;

А – оптическая плотность испытуемого раствора;

 – удельный показатель поглощения вещества;

b – длина оптического пути или толщина слоя, в сантиметрах.

В ряде случаев, даже при использовании монохроматического излучения могут наблюдаться отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера, обусловленные процессами диссоциации, ассоциации и комплексообразования.

Поэтому предварительно следует проверить линейность зависимости оптической плотности раствора от концентрации в аналитической области.

При наличии отклонений от линейной зависимости следует пользоваться не формулой (3), а экспериментально найденной зависимостью.

Обычно определение концентрации спектрофотометрическим методом проводят с использованием стандартного образца. Расчет концентрации основан на использовании уравнения:

где:

С и С0 – концентрации испытуемого раствора и раствора стандартного образца, соответственно;

А и А0 – оптические плотности испытуемого раствора и раствора стандартного образца, соответственно.

Концентрации испытуемого и стандартного раствора должны быть близки.

Вначале измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца, приготовленного, как указано в фармакопейной статье, затем проводят измерение оптической плотности испытуемого раствора. Второе измерение проводят сразу после первого, с использованием той же кюветы, в тех же экспериментальных условиях.

Метод с использованием стандартного образца является более точным и надежным. Возможность применения значения удельного показателя поглощения в каждом конкретном случае следует обосновывать. Обычно метод с использованием значения удельного показателя поглощения применим при допусках содержания анализируемого вещества не менее ±10 % от номинального содержания.

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ (анализ смесей) применяют для одновременного количественного определения нескольких компонентов лекарственных средств, каждое из которых подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера.

Количественное определение в многокомпонентном спектрофотометрическом анализе основывается обычно на использовании уравнения:

где:

Аi – оптическая плотность испытуемого раствора при i-ой длине волны;

Еij – показатели поглощения (зависящие от способа выражения концентрации) j-го компонента образца при i-ой аналитической длине волны;

cj – концентрация j-го компонента образца.

Соответствующие методики проведения анализа и расчетные формулы указываются в фармакопейных статьях.

Производная спектрофотометрия

В производной спектрофотометрии исходные спектры поглощения (нулевого порядка) преобразуются в спектры производных первого, второго и более высокого порядков.

Спектр первой производной представляет собой график зависимости градиента кривой поглощения (скорость изменения оптической плотности от длины волны, dA/dλ) от длины волны.

Спектр второй производной представляет собой график зависимости кривизны спектра поглощения (d2A/dλ2) от длины волны. Вторая производная при любой длине волны связана с концентрацией следующим соотношением:

где:

А– оптическая плотность при длине волны λ;

– удельный показатель поглощения при длине волны λ;

с– концентрация вещества в растворе, в граммах/100 мл;

l– толщина слоя, в сантиметрах.

Производная спектрофотометрия может быть использована как для целей идентификации веществ, так и для их количественного определения в многокомпонентных смесях, а также в тех случаях, когда имеется фоновое поглощение, вызванное присутствием веществ, содержание которых не регламентируется.

Разрешающая  способность

Если указано в фармакопейных статьях, записывают спектр второй производной для раствора 0,2 г/л толуола в метаноле, используя метанол в качестве раствора сравнения.

На спектре должен присутствовать небольшой отрицательный экстремум, расположенный между двумя большими отрицательными экстремумами при 261 нм и 268 нм, в соответствии с рис. 1.

Если нет других указаний в фармакопейных статьях, отношение А/B должно быть не менее 0,2.

Методика

Процедура анализа аналогична применяемой в обычной спектрофотометрии, но вместо оптических плотностей используют производные. Готовят раствор испытуемого образца, настраивают прибор в соответствии с инструкцией производителя и рассчитывают количество определяемого вещества, как указано в фармакопейной статье.

Рисунок 1 – Спектр второй производной раствора толуола (0,2 г/л) в метаноле

Скачать в PDF ОФС.1.2.1.1.0003.15 Спектрофотометрия в УФ и видимой областях

Источник: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-1-1-0003-15-spektrofotometriya-v-uf-i-vidimoj-oblastyah/

Спектрофотометр

Спектрофотометрия

Электронный прибор, с помощью которого определяется состав веществ и их соединений в эмульсиях, взвесях и растворах называется медицинским спектрофотометром.

Устройство имеет два наиболее известных названия: фотоэлектрический фотометр и фотоэлектроколориметр. Спектрофотометры используются в различных сферах, но больше всего они нашли свое применение в медицине и фармацевтике.

Приборы отличаются высокой точностью и позволяют сэкономить реактивы и время на проведения исследования.

Особенности спектрофотометров

Самые первые фотометры нуждались в участии медицинского работника для проведения исследования. Специалист должен был сравнивать и фиксировать полученные с устройства показатели. Данные сопоставлялись с общепринятыми нормативами. На смену таким приборам пришли автоматизированные фотоэлектроколориметры.

Спектрофотометры – это современное медицинское оборудование, которое предназначается для изучения и анализа свойств предметов либо веществ с помощью электромагнитного излучения. Световые лучи проходят сквозь пробу или отражаются от нее. Прибор сравнивает поток света, который первоначально направляется на биоматериал с излучением, проходящим сквозь образец либо отражающим от его поверхности.

Для проведения анализа сканируется широченный диапазон волн: начиная от 160 нм (ультрафиолет), заканчивая 3300 нм (инфракрасные лучи), с помощью чего получается максимально точная информация о веществе.

Спектрофотометрическая методика основана на том, что каждый предмет обладает особенными спектральными характеристиками. Именно поэтому во время проведения анализа не играет роли температурный режим и агрегатное состояние образца. Особенностью спектрофотометра является возможность проведения качественных и количественных исследований.

Главным плюсом фотоэлектрического фотометра есть вывод полученной информации на дисплей (лаборант может увидеть состав пробы, наличие и численность примесей). С помощью специальных световых фильтров устройство определяет в образце не менее 3-5 составляющих компонентов.

Сферы применения

Спектрофотометры используются для исследований в биохимии (анализируются липиды, электролиты, субстраты, ферменты), иммунохимии (проводится анализ ламбда, ферритин, миоглобин, микроальбумин, гаптоглобин), бактериологии.

Для анализа качества еды и воды (сточной, природной и питьевой) применяется фотоэлектроколориметр.

При определении качественных характеристик воды определяется мутность и цвет жидкости, наличие тяжелых металлов и поверхностно-активных компонентов, содержание нитритов, фосфатов, фенолов и сульфатов.

Спектрофотометр пригодится для проведения научных, гормональных, экологических и специальных исследований. В отделениях санитарно-эпидемиологического надзора обязательным является наличие данного прибора. Кроме медицины оборудование используется в сельском хозяйстве и промышленной отрасли.

Фотоэлектрический фотометр нужен для:

  • выявления чистоты исследуемых образцов и нахождения примесей;
  • измерения в жидкостях оптической плотности и ее изменений;
  • определения концентрации пробы (исследование проводится в медицинских учреждениях);
  • изучения, анализа состава и химического строения веществ, образцов и реактивов;
  • спектральной диагностики.

Фотоэлектроколориметр – это устройство, которое применяется для проведения различных исследований: медицинских; биологических; фармацевтических; химических. Благодаря точным результатам, которые появляются на экране оборудования, доктор может узнать характеристику реагентов и назначить пациенту эффективное лечение.

Как устроен прибор?

Абсолютно все автоматизированные фотоэлектроколориметры состоят из: источника света (вольфрамовой, дейтериевой или галогено-дейтериевой лампы); усилителя сигналов; фотоприемника; монохроматора; оптических составляющих (световодов, зеркала, призмы и стекла); отсека для реагента.

Монохроматор содержит дифракционную решетку либо призму, которые выделяют излучение определенной длины волны. В различных моделях есть от одного до четырех отсеков для проб. С помощью фотоприемников спектрофотометр фиксирует уровень светового излучения, который проходит сквозь биологический материал.

Наиболее современные приборы укомплектованы фотодиодной матрицей, в состав которой входит встроенный датчик.

Чип преобразует световой сигнал в электрический, это фиксируется микроконтроллером и высвечивается на мониторе оборудования.

Не достаточно мощные приборы обрабатывают волны с различной длиной постепенно, и только потом выводят результаты на дисплей. От количества фотодиодных датчиков зависит производительность и информативность спектрофотометра.

С помощью приборов с фотодиодной матрицей можно проводить оперативные исследования не отходя от производства либо во время возникновения химической реакции. Это позволяет детально проанализировать состояние реакционных веществ.

Особенности работы устройства

Спектрофотометрическая методика основана на измерении степени отражения или поглощения монохроматических световых лучей. Во время исследования посторонние факторы не могут влиять на результативность анализа.

Все приборы работают на двух разновидностях схем.

В первом случае на пробу попадает монохроматический световой луч с определенной длиной волны, который после прохождения через образец направляется на фотоприемник, измеряющий разницу между потоками.

Суть второй схемы заключается в том, что на реагент попадает световой поток прямо от лампы, затем монохроматор выделяет небольшой пучок и направляет его к фотоприемнику.

Спектрофотометры бывают однолучевыми и двухлучевыми. В приборах с одним лучом для измерения применяются коэффициенты коррекции. В случае двухлучевой диагностики один луч попадает на пробу, а второй – на эталонное значение. Оборудование с двумя лучами более точное, информативное и менее чувствительное к окружающим факторам.

При подборе устройства необходимо учитывать сферу его применения и выполняемые задачи. Фотоэлектрические фотометры бывают переносными и стационарными. Портативные аппараты имеют небольшой вес, компактные и легкие в использовании.

Стационарные приборы устанавливаются в медицинских учреждениях и диагностических центрах. С помощью этих устройств проводятся более сложные измерения.

Такие спектрофотометры могут подключаться к персональному компьютеру с помощью кабеля, а полученные данные подлежат архивированию, обработке и распечатке на принтере.

При выборе медицинского аппарата нужно учитывать: спектр действия (диапазон); длину волны; многофункциональность устройства; габариты; цену; вероятность проведения определенных исследований; количество секций для реагентов; способ получения результатов. Также необходимо обратить внимание на штатную комплектацию модели спектрометра, потому как практически все современные приборы продаются с кюветом и чашкой Петри.

Источник: https://FoodandHealth.ru/medodezhda-i-pribory/spektrofotometr/

Ваш педагог
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: